Рухома фаза еквівалентна рідкій фазі крові, і є різні речі, на які слід звернути увагу під час використання. Серед них є деякі «підводні камені», на які варто звернути увагу.
01. Виміряйте pH рухомої фази після додавання органічного розчинника
Якщо ви вимірюєте рН за допомогою органічної добавки, отриманий рН буде іншим, ніж до додавання органічного розчинника. Однак найголовніше – бути послідовним. Якщо ви завжди вимірюєте рН після додавання органічного розчинника, обов’язково вкажіть свої кроки в методі, який ви використовуєте, щоб інші дотримувалися того самого методу. Цей метод не є 100% точним, але принаймні він збереже метод послідовним. Це може бути важливішим, ніж отримання точного значення pH.
02. Буфер не використовується
Мета буфера - контролювати pH і запобігати його зміні. Багато інших методів змінюють рН рухомої фази, що може призвести до зміни часу утримування, форми піку та відповіді піку.
Мурашина кислота, TFA тощо не є буферами
03. Не використовується буфер у межах нормального діапазону pH
Кожен буфер має ширину діапазону 2 одиниць pH, у межах якого він забезпечує найкращу стабільність pH. Буфери за межами цього вікна не забезпечуватимуть ефективний опір змінам pH. Або використовуйте буфер у правильному діапазоні, або виберіть буфер, який покриває потрібний вам діапазон pH.
04. Додайте буфер до органічного розчину
Змішування буферного розчину з органічною фазою, швидше за все, призведе до випадання осаду буфера. У багатьох випадках, навіть якщо випали опади, їх все одно важко виявити. Не забувайте завжди додавати органічний розчин у водну фазу, що може значно зменшити ймовірність утворення буферного осаду.
05. Змішайте градієнт концентрації від 0% за допомогою насоса
Насоси, доступні сьогодні, можуть ефективно змішувати рухомі фази та проводити дегазацію, але не кожен, хто використовує ваш метод, матиме високоякісний насос. Змішайте A і B в єдиний розчин і запустіть його на 100% у мережі.
Наприклад, 950 мл органічної вихідної суміші можна приготувати шляхом змішування з 50 мл води. Перевагою цього є те, що він може зменшити різницю між ВЕРХ і зменшити ймовірність утворення бульбашок і опадів у системі. Варто зазначити, що співвідношення насосної суміші становить 95:5, що не означає, що час утримання попередньої суміші в пляшці також становить 95:5.
06. Для зміни буфера не використовується правильна модифікована кислота (основа).
Використовуйте лише кислоту або основу, які утворюють буферну сіль, яку ви використовуєте. Наприклад, натрій-фосфатний буфер слід готувати лише з фосфорної кислоти або гідроксиду натрію.
07. Не вказується вся інформація про буфер у методі, наприклад додавання 5 гфосфату натрію на 1000 мл води.
Тип буфера визначає діапазон pH, який можна буферизувати. Необхідна концентрація визначає силу буфера. 5 грамів безводного фосфату натрію та 5 грамів моногідрату фосфату натрію мають різну концентрацію буфера.
08. Додавання органічних розчинників перед перевіркою
Якщо в попередньому методі використовувався буферний розчин для базової лінії B, а у вашому методі використовується органічний розчин для базової лінії B, можна сподіватися, що буфер осадить у трубці насоса та головці насоса.
09. Підніміть пляшку та спорожніть останню краплю
Існує велика ймовірність того, що у вас не вистачить рухомої фази для завершення всього циклу, і ваш зразок буде диміти. Окрім можливості перегорання насосної системи та колонки, рухома фаза повністю випарується, а рухома фаза у верхній частині пляшки зміниться.
10. Використовуйте ультразвукову дегазацію рухомої фази
Найважливішим моментом є переконатися, що всі буферні солі розчинені, але це найгірший спосіб дегазації, оскільки він швидко нагріє рухому фазу, що призведе до випаровування органічних компонентів. Щоб уникнути непотрібних проблем пізніше, виділіть п’ять хвилин на вакуумну фільтрацію мобільної фази.
Час публікації: 27 серпня 2024 р