Рідинна хроматографія є основним методом перевірки вмісту кожного компонента та домішок у сировині, проміжних продуктах, препаратах і пакувальних матеріалах, але для багатьох речовин немає стандартних методів, на які можна покладатися, тому розробка нових методів неминуча. У розробці рідкофазних методів хроматографічна колонка є ядром рідинної хроматографії, тому вибір відповідної хроматографічної колонки має вирішальне значення. У цій статті автор пояснить, як вибрати колонку для рідинної хроматографії з трьох аспектів: загальні ідеї, міркування та сфера застосування.
A. Загальні ідеї щодо вибору колонок рідинної хроматографії
1. Оцініть фізичні та хімічні властивості аналіту: такі як хімічна структура, розчинність, стабільність (наприклад, чи легко він окислюється/відновлюється/гідролізується), кислотність і лужність тощо, особливо хімічна структура є ключовою фактор у визначенні властивостей, наприклад, кон'югована група має сильне ультрафіолетове поглинання та сильну флуоресценцію;
2. Визначте мету аналізу: чи потрібні висока сепарація, висока ефективність колонки, короткий час аналізу, висока чутливість, стійкість до високого тиску, довгий термін служби колонки, низька вартість тощо;
- Виберіть відповідну хроматографічну колонку: зрозумійте склад, фізичні та хімічні властивості хроматографічного наповнювача, такі як розмір частинок, розмір пор, температурний допуск, допуск до pH, адсорбція аналіту тощо.
- Міркування щодо вибору колонок для рідинної хроматографії
У цьому розділі обговорюватимуться фактори, які слід враховувати при виборі хроматографічної колонки з точки зору фізичних і хімічних властивостей самої хроматографічної колонки. 2.1 Матриця наповнювача
2.1.1 Силікагелева матриця Наповнювачем більшості колонок рідинної хроматографії є силікагель. Цей тип наповнювача має високу чистоту, низьку вартість, високу механічну міцність і легко модифікувати групи (такі як фенільні зв’язки, амінозв’язки, ціано зв’язки тощо), але значення рН і температурний діапазон, які він допускає, обмежені: Діапазон рН більшості силікагелевих наповнювачів матриці становить від 2 до 8, але діапазон рН спеціально модифікованих зв’язаних фаз із силікагелем може досягати 1,5–10, а також існують спеціально модифіковані зв’язані фази з силікагелем, які стабільні при низькому рН, такі як Agilent ZORBAX RRHD stablebond-C18, який стабільний при pH від 1 до 8; верхня межа температури силікагелевої матриці зазвичай становить 60 ℃, а деякі хроматографічні колонки можуть витримувати температуру 40 ℃ при високому pH.
2.1.2 Полімерна матриця Полімерними наповнювачами є переважно полістирол-дивінілбензол або поліметакрилат. Їх переваги в тому, що вони можуть переносити широкий діапазон рН – їх можна використовувати в діапазоні від 1 до 14, і вони більш стійкі до високих температур (можуть досягати вище 80 °C). Порівняно з наповнювачами C18 на основі кремнезему, цей тип наповнювача має сильнішу гідрофобність, а макропористий полімер є дуже ефективним у розділенні зразків, таких як білки. Його недоліки полягають у нижчій ефективності колони та меншій механічній міцності, ніж у наповнювачів на основі кремнезему. 2.2 Форма частинок
Більшість сучасних наповнювачів ВЕРХ є сферичними частинками, але іноді вони мають неправильну форму. Сферичні частинки можуть забезпечити нижчий тиск колони, вищу ефективність колони, стабільність і тривалий термін служби; при використанні високов’язких рухомих фаз (таких як фосфорна кислота) або коли розчин зразка є в’язким, нерегулярні частинки мають більшу питому поверхню, що є більш сприятливим для повної дії двох фаз, і ціна є відносно низькою. 2.3 Розмір частинок
Чим менший розмір частинок, тим вища ефективність колонки та вище розділення, але тим гірша стійкість до високого тиску. Найбільш часто використовуваною колонкою є колонка з розміром частинок 5 мкм; якщо вимога до розділення висока, можна вибрати наповнювач 1,5-3 мкм, що сприяє вирішенню проблеми розділення деяких складних матриць і багатокомпонентних зразків. UPLC може використовувати наповнювачі 1,5 мкм; Наповнювачі з розміром частинок 10 мкм або більше часто використовуються для напівпрепаративних або препаративних колонок. 2.4 Вміст вуглецю
Вміст вуглецю відноситься до частки зв’язаної фази на поверхні силікагелю, яка пов’язана з питомою площею поверхні та покриттям зв’язаної фази. Високий вміст вуглецю забезпечує високу ємність колонки та високу роздільну здатність, і часто використовується для складних зразків, що вимагають високого розділення, але через тривалий час взаємодії між двома фазами час аналізу є довгим; Хроматографічні колонки з низьким вмістом вуглецю мають коротший час аналізу та можуть демонструвати різну селективність і часто використовуються для простих зразків, які потребують швидкого аналізу, та зразків, які потребують високих умов водної фази. Як правило, вміст вуглецю в C18 коливається від 7% до 19%. 2.5 Розмір пор і питома поверхня
Адсорбційні середовища ВЕРХ — це пористі частинки, і більшість взаємодій відбувається в порах. Тому молекули повинні увійти в пори, щоб адсорбуватися та розділятися.
Розмір пор і питома площа поверхні - два взаємодоповнюючих поняття. Маленький розмір пор означає велику питому поверхню, і навпаки. Велика питома поверхня може збільшити взаємодію між молекулами зразка та зв’язаними фазами, посилити утримування, збільшити завантаження зразка та місткість колонки, а також відокремлення складних компонентів. До цього виду наповнювачів належать повністю пористі наповнювачі. Для тих, хто має високі вимоги до розділення, рекомендується вибирати наповнювачі з великою питомою поверхнею; мала питома площа поверхні може зменшити протитиск, підвищити ефективність колонки та скоротити час рівноваги, що підходить для градієнтного аналізу. До цього типу наповнювачів відносяться наповнювачі ядро-оболонка. Виходячи з передумови забезпечення розділення, рекомендується вибирати наповнювачі з малою питомою поверхнею для тих, хто має високі вимоги до ефективності аналізу. 2.6 Об'єм пор і механічна міцність
Об’єм пор, також відомий як «об’єм пор», відноситься до розміру об’єму пустот на одиницю частинки. Він може добре відобразити механічну міцність наповнювача. Механічна міцність наповнювачів з великим об'ємом пор трохи слабша, ніж у наповнювачів з малим об'ємом пор. Наповнювачі з об’ємом пор менше або дорівнює 1,5 мл/г здебільшого використовуються для розділення за допомогою ВЕРХ, тоді як наповнювачі з об’ємом пор більше 1,5 мл/г переважно використовуються для молекулярно-ексклюзивної хроматографії та хроматографії низького тиску. 2.7 Норма обмеження
Блокування може зменшити хвостові піки, спричинені взаємодією між сполуками та відкритими силанольними групами (такими як іонні зв’язки між лужними сполуками та силанольними групами, сили Ван-дер-Ваальса та водневі зв’язки між кислотними сполуками та силанольними групами), тим самим покращуючи ефективність колонки та форму піку . Незакриті зв’язані фази вироблятимуть різну селективність відносно закритих зв’язаних фаз, особливо для полярних зразків.
- Сфера застосування різних колонок рідинної хроматографії
У цьому розділі буде описано область застосування різних типів колонок рідинної хроматографії в деяких випадках.
3.1 Обернено-фазова хроматографічна колонка С18
Колонка C18 є найбільш часто використовуваною колонкою з оберненою фазою, яка відповідає тестам на вміст і домішки більшості органічних речовин і застосовна до середньополярних, слабополярних і неполярних речовин. Тип і характеристики хроматографічної колонки C18 слід вибирати відповідно до конкретних вимог до розділення. Наприклад, для речовин із високими вимогами до розділення часто використовуються специфікації 5 мкм*4,6 мм*250 мм; для речовин зі складними розділовими матрицями та подібною полярністю можна використовувати специфікації 4 мкм*4,6 мм*250 мм або менші розміри частинок. Наприклад, автор використовував колонку 3 мкм*4,6 мм*250 мм для виявлення двох генотоксичних домішок в API целекоксибу. Розділення двох речовин може досягати 2,9, що є відмінним показником. Крім того, за умови забезпечення розділення, якщо потрібен швидкий аналіз, часто вибирають коротку колонку 10 мм або 15 мм. Наприклад, коли автор використовував РХ-МС/МС для виявлення генотоксичної домішки в API піперахіну фосфату, використовувалася колонка 3 мкм*2,1 мм*100 мм. Розділення між домішкою та основним компонентом становило 2,0, і виявлення зразка може бути завершено за 5 хвилин. 3.2 Обернено-фазова фенільна колонка
Фенільна колонка також є типом колонки з оберненою фазою. Цей тип колонки має сильну селективність щодо ароматичних сполук. Якщо відгук ароматичних сполук, виміряний звичайною колонкою C18, є слабким, ви можете розглянути питання про заміну фенілової колонки. Наприклад, коли я робив целекоксиб API, відповідь основного компонента, виміряна феніловою колонкою того ж виробника та тієї самої специфікації (усі 5 мкм*4,6 мм*250 мм), була приблизно в 7 разів більшою, ніж у колонці C18. 3.3 Нормальна фазова колонка
Як ефективне доповнення до колонки з оберненою фазою колонка з нормальною фазою підходить для високополярних сполук. Якщо пік все ще дуже швидкий при елююванні з більш ніж 90% водної фази в колонці з оберненою фазою та навіть близький до піку розчинника та перекривається з ним, ви можете розглянути можливість заміни колонки з нормальною фазою. Цей тип колонки включає гілієву колонку, аміноколонку, ціанову колонку тощо.
3.3.1 Гілова колонка. Гілова колонка зазвичай містить гідрофільні групи в зв’язаному алкільному ланцюзі для посилення реакції на полярні речовини. Цей тип колонки підходить для аналізу цукрових речовин. Автор використовував цей тип колонки, коли робив вміст і супутні речовини ксилози та її похідних. Ізомери похідної ксилози також можуть бути добре розділені;
3.3.2 Аміно- та ціано-колонка Аміно- та ціано-колонка стосуються введення аміно- та ціано-модифікацій на кінці зв’язаного алкільного ланцюга, відповідно, для покращення селективності для спеціальних речовин: наприклад, аміно-колонка є хорошим вибором для розділення цукрів, амінокислот, основ і амідів; ціаноколонка має кращу селективність при розділенні гідрогенізованих і негідрованих структурно подібних речовин завдяки наявності спряжених зв'язків. Колонку з амінокислотами та колонку з ціановою кислотою часто можна перемикати між колонкою з нормальною фазою та колонкою з оберненою фазою, але часте перемикання не рекомендується. 3.4 Хіральна колонка
Хіральна колонка, як випливає з назви, підходить для розділення та аналізу хіральних сполук, особливо в галузі фармацевтики. Цей тип колонки можна розглядати, коли звичайні колонки зі зворотною фазою та нормальною фазою не можуть досягти розділення ізомерів. Наприклад, автор використовував 5 мкм*4,6 мм*250 мм хиральну колонку для розділення двох ізомерів 1,2-дифенілетилендіаміну: (1S, 2S)-1,2-дифенілетилендіаміну та (1R, 2R)-1,2 -дифенілетилендіамін, і поділ між ними досяг приблизно 2,0. Однак хіральні колони дорожчі, ніж інші типи колон, зазвичай 1W+/шт. Якщо є потреба в таких колонках, то підрозділу необхідно скласти достатній бюджет. 3.5 Іонообмінна колонка
Іонообмінні колонки підходять для розділення та аналізу заряджених іонів, таких як іони, білки, нуклеїнові кислоти та деякі цукрові речовини. За типом наповнювача вони поділяються на катіонообмінні, аніонообмінні та сильні катіонообмінні.
Катіонообмінні колонки включають колонки на основі кальцію та водню, які в основному підходять для аналізу катіонних речовин, таких як амінокислоти. Наприклад, автор використовував колонки на основі кальцію при аналізі глюконату кальцію та ацетату кальцію в промивному розчині. Обидві речовини мали сильні реакції при λ=210 нм, а ступінь поділу досягав 3,0; автор використовував колонки на основі водню при аналізі речовин, пов'язаних з глюкозою. Кілька основних споріднених речовин – мальтоза, мальтотріоза та фруктоза – мали високу чутливість під диференціальними детекторами з межею виявлення лише 0,5 ppm та ступенем розділення 2,0-2,5.
Аніонообмінні колонки в основному підходять для аналізу аніонних речовин, таких як органічні кислоти та іони галогенів; сильні катіонообмінні колонки мають більш високу іонообмінну здатність і селективність і підходять для розділення та аналізу складних зразків.
Вище наведено лише ознайомлення з типами та діапазонами застосування кількох поширених колонок для рідинної хроматографії в поєднанні з власним досвідом автора. Існують інші спеціальні типи хроматографічних колонок у реальному застосуванні, такі як хроматографічні колонки з великими порами, хроматографічні колонки з дрібними порами, колонки афінної хроматографії, багатомодові хроматографічні колонки, надвисокоефективні рідинні хроматографічні колонки (UHPLC), надкритичні рідинні хроматографічні колонки ( SFC) тощо. Вони відіграють важливу роль у різних сферах. Конкретний тип хроматографічної колонки слід вибирати відповідно до структури та властивостей зразка, вимог до розділення та інших цілей.
Час публікації: 14 червня 2024 р