Принципи та методи кількісного аналізу за допомогою рідинної хроматографії

Механізм розділення рідинної хроматографії заснований на різниці спорідненості компонентів у суміші до двох фаз.

Відповідно до різних нерухомих фаз рідинна хроматографія поділяється на рідинно-тверду хроматографію, рідинно-рідинну хроматографію та хроматографію зв’язаної фази.Найбільш широко використовуються рідинно-тверда хроматографія з силікагелем як наповнювач і хроматографія зв’язаної фази з мікрокремнеземом як матриця.

За формою нерухомої фази рідинну хроматографію можна розділити на колонкову хроматографію, паперову хроматографію та тонкошарову хроматографію.Відповідно до адсорбційної здатності її можна розділити на адсорбційну хроматографію, розподільчу хроматографію, іонообмінну хроматографію та гельпроникну хроматографію.

В останні роки до системи рідинної колонкової хроматографії було додано систему потоку рідини під високим тиском, щоб рухлива фаза швидко протікала під високим тиском для покращення ефекту розділення, тому високоефективна (також відома як рідинна хроматографія високого тиску) виникло.

ЧАСТИНА
01 Принцип кількісного аналізу рідинної хроматографії

Для кількісного визначення на основі якісних стандартів потрібні чисті речовини;

Кількісне визначення рідинною хроматографією є відносно кількісним методом: тобто кількість аналіту в суміші оцінюється за відомою кількістю чистого стандартного зразка.

ЧАСТИНА
02 Основи кількісного визначення за допомогою рідинної хроматографії

Кількість виміряного компонента (W) пропорційна значенню відгуку (A) (висота піку або площа піку), W=f×A.

Коефіцієнт кількісної корекції (f): це константа пропорційності формули кількісного розрахунку, і його фізичне значення є кількістю вимірюваного компонента, представленого значенням одиничного відгуку (площа піку).

Кількісний поправочний коефіцієнт можна отримати з відомої кількості стандартної проби та її значення відгуку.

Виміряйте значення відгуку невідомого компонента, і кількість компонента можна отримати за допомогою кількісного поправочного коефіцієнта.

ЧАСТИНА
03 Загальні терміни в кількісному аналізі

Зразок (проба): розчин, що містить аналіт для хроматографічного аналізу.Поділяються на стандартні та невідомі зразки.

Стандарт: чистий продукт із відомою концентрацією.Невідомий зразок (невідомо): Суміш, концентрацію якої необхідно перевірити.

Вага зразка: первісне зважування зразка, що підлягає випробуванню.

Розведення: коефіцієнт розведення невідомого зразка.

Компонент: хроматографічний пік, який підлягає кількісному аналізу, тобто аналіт, вміст якого невідомий.

Кількість компонента (кількість): вміст (або концентрація) досліджуваної речовини.

Цілісність: обчислювальний процес вимірювання площі піку хроматографічного піку комп’ютером.

Калібрувальна крива: лінійна крива залежності вмісту компонента від значення відповіді, встановлена ​​на основі відомої кількості стандартної речовини, яка використовується для визначення невідомого вмісту аналіту.

ЧАСТИНА
04 Кількісний аналіз рідинної хроматографії

1. Виберіть хроматографічний метод, придатний для кількісного аналізу:

l Підтвердьте пік виявленого компонента та досягніть роздільної здатності (R), що перевищує 1,5

l Визначте консистенцію (чистоту) хроматографічних піків тестованих компонентів

l Визначити межу виявлення та межу кількісного визначення методу;чутливість і лінійний діапазон

2. Побудуйте калібрувальну криву зі стандартними зразками різних концентрацій

3. Перевірте точність і прецизійність кількісних методів

4. Використовуйте відповідне програмне забезпечення для керування хроматографією, щоб здійснити збір зразків, обробити дані та звітувати про результати

ЧАСТИНА
05 Ідентифікація кількісних піків (якісних)

Якісно визначте кожен хроматографічний пік для кількісного визначення

Спочатку використовуйте стандартний зразок, щоб визначити час утримування (Rt) хроматографічного піку, який потрібно кількісно визначити.Порівнюючи час утримування, знайдіть компонент, що відповідає кожному хроматографічному піку в невідомому зразку.Хроматографічний якісний метод полягає в порівнянні часу утримання зі стандартним зразком.Критерій Недостатнійподальше підтвердження (якісне)

1. Стандартний спосіб додавання

2. Використовуйте інші методи одночасно: інші хроматографічні методи (змініть механізм, наприклад: використання різних хроматографічних колонок), інші детектори (PDA: порівняння спектрів, пошук у бібліотеці спектрів; MS: аналіз мас-спектру, пошук у бібліотеці спектрів)

3. Інші інструменти та методи

ЧАСТИНА
06 Підтвердження кількісної консистенції піку

Підтвердьте консистенцію хроматографічного піку (чистота)

Переконайтеся, що під кожним хроматографічним піком є ​​лише один вимірюваний компонент

Перевірте наявність перешкод від речовин, що спільно виділяються (домішок)

Методи підтвердження консистенції хроматографічного піку (чистоти)

Порівняння спектрограм з фотодіодними матрицями (PDA) детекторами

Ідентифікація піку чистоти

2996 Теорія кута чистоти

Кількісні методи, які зазвичай використовуються в ЧАСТИНІ 07

Метод стандартної кривої, розділений на метод зовнішнього стандарту та метод внутрішнього стандарту:

1. Метод зовнішнього стандарту: найчастіше використовується в рідинній хроматографії

Серія стандартних зразків із відомими концентраціями була підготовлена ​​з використанням чистих зразків сполук, що підлягають тестуванню, як стандартних зразків.вводять у колонку до значення відповіді (площа піку).
У межах певного діапазону існує хороша лінійна залежність між концентрацією стандартного зразка та значенням відповіді, а саме W=f×A, і будується стандартна крива.

За тих самих експериментальних умов введіть невідомий зразок, щоб отримати значення відгуку компонента, який потрібно виміряти.Відповідно до відомого коефіцієнта f можна отримати концентрацію компонента, який потрібно виміряти.

Переваги методу зовнішнього стандарту:проста операція та обчислення, це загальновживаний кількісний метод;відсутність потреби в виявленні та елююванні кожного компонента;необхідний стандартний зразок;умови вимірювання стандартного зразка та невідомого зразка повинні бути узгодженими;об'єм ін'єкції повинен бути точним.

Недоліки методу зовнішнього стандарту:Умови експерименту повинні бути високими, наприклад, чутливість детектора, швидкість потоку та склад рухомої фази не можуть бути змінені;об'єм кожної ін'єкції повинен мати хорошу повторюваність.

2. Метод внутрішнього стандарту: точний, але складний, найчастіше використовується в стандартних методах

Відома кількість внутрішнього стандарту додається до стандарту, щоб отримати змішаний стандарт, і готується серія робочих стандартів відомої концентрації.Молярне співвідношення стандарту до внутрішнього стандарту в змішаному стандарті залишається незмінним.Введіть у хроматографічну колонку та прийміть (площу піку стандартного зразка/площу піку внутрішнього стандартного зразка) як значення відповіді.Відповідно до лінійної залежності між значенням відгуку та концентрацією робочого стандарту, а саме W=f×A, будують стандартну криву.

Відома кількість внутрішнього стандарту додається до невідомого зразка та вводиться в колонку для отримання значення відгуку компонента, який потрібно виміряти.Відповідно до відомого коефіцієнта f можна отримати концентрацію компонента, який потрібно виміряти.

Характеристики методу внутрішнього стандарту:Під час операції зразок і внутрішній стандарт змішуються разом і вводяться в хроматографічну колонку, тому, поки відношення кількості вимірюваного компонента до внутрішнього стандарту в змішаному розчині є постійним, зміна об’єму зразка не вплине на кількісні результати..Метод внутрішнього стандарту компенсує вплив об’єму зразка і навіть рухомої фази та детектора, тому він більш точний, ніж метод зовнішнього стандарту.

ЧАСТИНА
08 Фактори, що впливають на результати кількісного аналізу

Погана точність може бути викликана:

Неправильна інтеграція площі піку, розкладання зразка або домішки, внесені під час підготовки зразка, флакон із зразком не запечатаний, випаровування зразка або розчинника, неправильне приготування зразка, проблеми з ін’єкцією зразка, неправильне приготування внутрішнього стандарту

Можливі причини низької точності:

Неправильна інтеграція піків, проблеми з ін’єкцією або інжектором, розкладання зразка або домішки, внесені під час підготовки зразка, хроматографічні проблеми, погіршення реакції детектора