хроматографія, також відома як «хроматографічний аналіз», «хроматографія», — це метод розділення та аналізу, який має дуже широкий спектр застосувань в аналітичній хімії, органічній хімії, біохімії та інших областях.
Основоположником хроматографії є російський ботанік М.Цветтер.У 1906 році російський ботанік Цветтер опублікував результати свого експерименту: щоб відокремити рослинні пігменти, він вилив петролейний ефірний екстракт, що містить рослинні пігменти, у скляну трубку з порошком карбонату кальцію та промив його петролейним ефіром зверху вниз.Оскільки різні пігменти мають різну адсорбційну здатність на поверхні частинок карбонату кальцію, у процесі вилуговування різні пігменти рухаються вниз з різною швидкістю, таким чином утворюючи смуги різного кольору.Пігментні компоненти розділяли.Цей метод розділення він назвав хроматографією.
Схематичне зображення експерименту з виділення пігменту з листя рослини
З безперервним розвитком методів розділення все більше і більше безбарвних речовин стають об’єктами розділення, хроматографія також поступово втратила значення «колір», але ця назва використовується і сьогодні.
Хроматографічна класифікація
Суть хроматографії полягає в процесі, в якому молекули, які необхідно розділити, розподіляються та врівноважуються між нерухомою та рухомою фазами.Різні речовини по-різному розподіляються між двома фазами, що змушує їх рухатися з різними швидкостями разом з рухомою фазою.При русі рухомої фази різні компоненти в суміші відокремлюються один від одного на нерухомій фазі.Залежно від механізму їх можна розділити на кілька категорій.
1, за класифікацією двофазного фізичного стану
Рухома фаза: газова хроматографія, рідинна хроматографія, надкритична рідинна хроматографія
Нерухома фаза: газ-тверде тіло, газ-рідина;Рідина-тверде, рідина-рідина
2, відповідно до форми класифікації стаціонарної фази
Колонкова хроматографія: наповнена колонкова хроматографія, капілярна колонкова хроматографія, мікроущільнена колонкова хроматографія, препаративна хроматографія
Плоска хроматографія: паперова хроматографія, тонкошарова хроматографія, полімерна мембранна хроматографія
3, класифіковані за механізмом поділу
Адсорбційна хроматографія: різні компоненти розділені відповідно до їх адсорбційної та десорбційної здатності на адсорбентах
Розподільча хроматографія: різні компоненти розділяють відповідно до їх розчинності в розчиннику
Молекулярна ексклюзійна хроматографія: відповідно до розміру молекулярного розміру поділу ln іонообмінна хроматографія: різні компоненти спорідненості для поділу іонообмінної смоли
Афінна хроматографія: розділення за допомогою наявності специфічної спорідненості між біологічними макромолекулами
Капілярний електрофорез: компоненти були розділені відповідно до відмінностей у рухливості та/або поведінці розподілу
Хіральна хроматографія використовується для розділення та аналізу хіральних лікарських засобів, які можна розділити на три категорії: метод реагенту хіральної дериватизації;Адитивний метод хіральної рухомої фази;Хіральний метод розділення стаціонарної фази
Основна термінологія хроматографії
Криві, отримані шляхом побудови сигналів відповіді компонентів після детектування хроматографічного розділення в залежності від часу, називаються хроматограмами.
Базова лінія:За певних хроматографічних умов крива сигналу, що генерується, коли тільки рухома фаза проходить через систему детектора, називається базовою лінією, як показано на лінії ot.Коли умови експерименту були стабільними, базовою лінією була лінія, паралельна горизонтальній осі.Базова лінія відображає шум приладу, головним чином детектора, з часом.
Висота піку:вертикальна відстань між точкою хроматографічного піку та базовою лінією, позначена h, як показано лінією АВ.
Ширина області:Ширина області хроматографічного піку безпосередньо залежить від ефективності розділення.Існує три методи опису ширини хроматографічного піку: стандартне відхилення σ, ширина піку W і FWHM W1/2.
Стандартне відхилення (σ):σ — це половина відстані між двома точками перегину на кривій нормального розподілу, а значення σ вказує на ступінь дисперсії компонентів від колони.Чим більше значення σ, тим більше дисперговані компоненти стоків і тим гірший ефект розділення.І навпаки, компоненти стоків концентруються, а ефект розділення хороший.
Ширина піку W:Точки перетину з обох сторін хроматографічного піку використовуються як дотичні лінії, а точка перетину базової лінії називається шириною піку або шириною базової лінії, яка також може бути виражена як W, як показано на малюнку IJ.Відповідно до принципу нормального розподілу можна довести, що співвідношення між шириною піку та стандартним відхиленням становить W=4σ.
W1/2:Ширина піку на половині висоти піку називається FWHM, як показано для відстані GH.W1/2=2,355σ, W=1,699W1/2.
W1/2, W є похідними від σ і використовуються для обчислення площі піків на додаток до вимірювання ефекту колонки.Вимірювання FWHM більш зручно і найчастіше використовується.
стислий підсумок
За допомогою хроматографічної кривої пікового відтоку можна досягти наступних цілей:
a, Якісний аналіз проводили на основі значення збереження хроматографічних піків
b, кількісний аналіз на основі площі або піку хроматографічного піку
C. Ефективність розділення колонки оцінювали відповідно до величини утримання та ширини піку хроматографічного піку
Формула розрахунку бере участь у хроматографії
1. Значення збереження
Значення утримування – це параметр, який використовується для опису ступеня, до якого компонент зразка утримується в колонці, і використовується як індикатор хроматографічної характеристики.Його спосіб представлення такий:
Час утримання tR
Час смертіtM
Відрегулюйте час утримання tR'=tR-tM
(Загальний час, проведений у стаціонарній фазі)
Обсяг утримання
VR=tR*F. (незалежно від швидкості рухомої фази)
Мертвий об'єм
VM=tM*Fc
(Простір, не зайнятий нерухомою фазою на шляху потоку від інжектора до детектора)
Відрегулюйте об’єм утримання VR'=t'R*ФК
2. Відносне значення збереження
Відносне значення утримування, також відоме як коефіцієнт поділу, коефіцієнт розподілу або коефіцієнт відносної ємності, є відношенням відкоригованого часу утримування (об’єму) досліджуваного компонента до відкоригованого часу утримання (об’єму) стандарту за певних хроматографічних умов.
Відносні значення утримування використовувалися для усунення впливу певних робочих умов, таких як швидкість потоку та втрати фіксації, на значення утримання.Стандартом у відносному значенні утримування може бути компонент у досліджуваному зразку або сполука, додана штучно.
3. Індекс збереження
Індекс утримування — це індекс утримування речовини i, що підлягає випробуванню, у фіксованому розчині X. В якості еталонних речовин вибирають два n-алани, один з яких має число вуглецю N, а інший — N+n.Їх скоригований час утримування дорівнює t 'r (N) і t 'r (N+n), відповідно, так що скоригований час утримування t 'r (i) речовини i, що підлягає випробуванню, знаходиться точно між ними, тобто t 'r (N).
Індекс утримання можна розрахувати наступним чином.
4. Коефіцієнт ємності (k)
У стані рівноваги відношення маси компонента в нерухомій фазі (s) до рухомої фази (m) називається коефіцієнтом ємності.Формула така:
5、Коефіцієнт розподілу (K) У стані рівноваги це відношення концентрації компонента в нерухомій фазі (s) до рухомої фази (m), яке називається коефіцієнтом розподілу.Формула така
Співвідношення між K і k:
Він відображає тип колони і її вузла важливі властивості конструкції
стислий підсумок
Співвідношення між значенням збереження та коефіцієнтом ємності та коефіцієнтом розподілу:
Хроматографічне розділення ґрунтується на різниці в здатності кожного компонента до адсорбції або розчинення у фіксованому відносному зразку, яка може бути кількісно виражена розміром значення коефіцієнта розподілу K (або коефіцієнта ємності k).
Компоненти з сильною здатністю до адсорбції або розчинення мають великий коефіцієнт розподілу (або коефіцієнт ємності) і тривалий час утримання.Навпаки, компоненти зі слабкою адсорбцією або розчинністю мають малий коефіцієнт розподілу та короткий час утримання.
Основи теорії хроматографії
1. Теорія лотка
(1) Висунута -- термодинамічна теорія
Це почалося з моделі баштової пластини, запропонованої Мартіном і Сінгом.
Фракціонуюча колона: у лотку протягом кількох разів газо-рідинна рівновага, відповідно до точки кипіння різного поділу.
Стовпець: Компоненти збалансовані кількома розподілами між двома фазами та розділені відповідно до різних коефіцієнтів розподілу.
(2) Гіпотеза
(1) У колонці багато тарілок, і компоненти можуть швидко досягти рівноваги розподілу в межах інтервалу тарілки (тобто висоти тарілки).
(2) Рухома фаза надходить у колонку не безперервно, а пульсуючи, тобто кожен прохід є об'ємом колонки.
(3) Коли зразок додавали до кожної пластини колонки, дифузією зразка вздовж осі колонки можна було знехтувати.
(4) Коефіцієнт розподілу однаковий на всіх лотках, незалежно від кількості компонентів.Тобто коефіцієнт розподілу постійний для кожного табану.
(3) Принцип
Принципова схема теорії лотка
Якщо компонент одиничної маси, а саме m=1 (наприклад, 1 мг або 1 мкг), додається до лотка № 0 і після рівноваги розподілу, оскільки k=1, а саме ns=nm, nm=ns=0,5.
Коли об’єм газу-носія пластини (lΔV) потрапляє на пластину 0 у формі пульсації, газ-носій, що містить компонент nm у газовій фазі, штовхається до пластини 1. У цей час компонент ns у рідкій фазі пластини 0 і компонент nm у газовій фазі пластини 1 буде перерозподілено між двома фазами.Таким чином, загальна кількість компонентів, що міститься на пластині 0, становить 0,5, у якій кожна газова та рідка фази становлять 0,25, а загальна кількість, що міститься на пластині 1, також становить 0,5.Газова і рідка фази також були 0,25.
Цей процес повторюється кожного разу, коли в колонку пульсує новий об’єм газу-носія пластини (див. таблицю нижче).
(4) Рівняння хроматографічної кривої відтоку
σ — стандартне відхилення, — час утримання, C — концентрація в будь-який час,
C — концентрація введення, тобто загальна кількість компонентів (площа піку A).
(5) параметри ефективності колони
При постійному tR чим менше W або w 1/2 (тобто чим вужчий пік), тим більша кількість теоретичних тарілок n, тим менша висота теоретичної тарілки і тим вище ефективність розділення колони.Те саме стосується ефективної теорії tray neff.Тому теоретична кількість лотків є показником для оцінки ефективності колон.
(5) Характеристики та недоліки
> Переваги
Теорія лотка є напівемпіричною і пояснює форму кривої відтоку
Проілюстровано процеси розподілу та розділення компонентів
Запропоновано показник для оцінки ефективності колонки
> Обмеження
Компоненти не можуть досягти рівноваги розподілу в двох фазах:
Не можна ігнорувати поздовжню дифузію компонентів у колоні:
Вплив різних кінетичних факторів на процес масообміну не розглядався.
Зв'язок між ефектом колони та швидкістю потоку рухомої фази не можна пояснити:
Неясно, які основні фактори впливають на ефект колонки
Ці проблеми задовільно вирішені в теорії курсу.
2. Теорія курсу
У 1956 році голландський вчений VanDeemter et al.увібрав концепцію теорії лотка та об’єднав кінетичні фактори, що впливають на висоту лотка, висунув кінетичну теорію хроматографічного процесу – теорію швидкості та вивів рівняння Ван Деемтера.Він розглядає хроматографічний процес як динамічний нерівноважний процес і вивчає вплив кінетичних факторів на розширення піку (тобто ефект колонки).
Пізніше Giddings and Snyder et al.запропонував рівняння швидкості рідинної хроматографії (а саме рівняння Гіддінгса), засноване на рівнянні Ван Деемтера (пізніше назване рівнянням швидкості газової хроматографії) і відповідно до різниці властивостей рідини та газу.
(1) Рівняння Ван Деемтера
Де: H: висота дошки
A: коефіцієнт вихрової дифузії
B: коефіцієнт молекулярної дифузії
C: коефіцієнт опору масопередачі
(2) Рівняння Гіддінгса
Кількісний та якісний аналіз
(1) Якісний аналіз
Якісний хроматографічний аналіз полягає у визначенні сполук, представлених кожним хроматографічним піком.Оскільки різні речовини мають певні значення утримування за певних хроматографічних умов, значення утримання можна використовувати як якісний показник.Різні хроматографічні якісні методи в даний час базуються на значеннях утримання.
Однак різні речовини можуть мати подібні або однакові значення утримування за однакових хроматографічних умов, тобто значення утримування не є винятковими.Таким чином, важко охарактеризувати абсолютно невідомий зразок лише на основі значень збереження.Якщо на основі розуміння джерела, природи та призначення зразка можна зробити попереднє судження про склад зразка, і можна використати наступні методи для визначення сполуки, представленої хроматографічним піком.
1. Якісний контроль з використанням чистих речовин
За певних хроматографічних умов невідомий має лише певний час утримання.Отже, невідому можна якісно ідентифікувати, порівнюючи час утримування відомої чистої речовини за однакових хроматографічних умов з часом утримування невідомої речовини.Якщо вони однакові, невідома речовина може бути відомою чистою речовиною;В іншому випадку невідоме не є чистою речовиною.
Метод контролю чистої речовини застосовний лише до невідомої речовини, склад якої відомий, відносно простий і чиста речовина якої відома.
2. Метод відносної вартості утримання
Відносне значення збереження α відноситься до коригування між компонентом i та стандартними матеріалами Співвідношення значень збереження:
Він змінюється лише зі зміною температури фіксатора та колонки і не має нічого спільного з іншими умовами експлуатації.
При певній стаціонарній фазі та температурі колонки скориговані значення утримання компонента i та еталонної речовини s вимірюються відповідно, а потім розраховуються відповідно до наведеної вище формули.Отримані значення відносного утримання можна якісно порівняти з відповідними значеннями в літературі.
3, додавання відомих речовин для збільшення висоти піку методом
Коли в невідомому зразку є багато компонентів, отримані хроматографічні піки надто щільні, щоб їх було легко ідентифікувати за допомогою вищевказаного методу, або коли невідомий зразок використовується лише для аналізу за певним елементом.
«Спочатку робиться хроматограма невідомого зразка, а потім додається відома речовина до невідомого зразка».Для таких речовин можуть бути відомі компоненти з підвищеною висотою піку.
4. Зберегти якісний метод індексу
Індекс утримування представляє поведінку утримування речовин на фіксаторах і наразі є найбільш широко використовуваним і міжнародно визнаним якісним індексом у ГХ.Він має такі переваги, як хороша відтворюваність, єдиний стандарт і малий температурний коефіцієнт.
Індекс утримання пов'язаний лише з властивостями нерухомої фази та температурою колонки, але не з іншими експериментальними умовами.Його точність і відтворюваність чудові.Поки температура колонки є такою ж, як температура нерухомої фази, для ідентифікації можна застосовувати літературне значення, і немає необхідності використовувати чистий матеріал для порівняння.
(2) Кількісний аналіз
Основа хроматографічного кількісного визначення:
Завдання кількісного аналізу - знайти сто компонентів у змішаній пробі
Дробовий зміст.Хроматографічне кількісне визначення ґрунтувалося на наступному: коли робочі умови були послідовними, було
Маса (або концентрація) вимірюваного компонента визначається сигналом відповіді, який видає детектор
Це пропорційно.а саме:
Основа хроматографічного кількісного визначення:
Завдання кількісного аналізу - знайти сто компонентів у змішаній пробі
Дробовий зміст.Хроматографічне кількісне визначення ґрунтувалося на наступному: коли робочі умови були послідовними, було
Маса (або концентрація) вимірюваного компонента визначається сигналом відповіді, який видає детектор
Це пропорційно.а саме:
1. Метод вимірювання площі піку
Площа піку є основними кількісними даними, які надає хроматограма, і точність вимірювання площі піку безпосередньо впливає на кількісні результати.Для хроматографічних піків з різною формою піків використовувалися різні методи вимірювання.
У кількісному аналізі важко знайти точне значення озимих:
З одного боку, через труднощі точного вимірювання абсолютного об’єму впорскування: з іншого боку
Площа піку залежить від хроматографічних умов, і хроматографічну смужку слід підтримувати під час вимірювання значення
Це не можливо і не зручно робити те саме.І навіть якщо ви можете зробити це правильно
Точне значення також тому, що єдиного стандарту немає і його неможливо застосувати безпосередньо.
2.Кількісний поправочний коефіцієнт
Визначення кількісного поправочного коефіцієнта: кількість компонентів, що надходять на детектор (м)
Відношення площі його хроматографічного піку (A) або висоти піку () є константою пропорційності (,
Константу пропорційності називають абсолютним поправочним коефіцієнтом для компонента.
У кількісному аналізі важко знайти точне значення озимих:
З одного боку, через труднощі точного вимірювання абсолютного об’єму впорскування: з іншого боку
Площа піку залежить від хроматографічних умов, і хроматографічну смужку слід підтримувати під час вимірювання значення
Це не можливо і не зручно робити те саме.І навіть якщо ви можете зробити це правильно
Точне значення також тому, що єдиного стандарту немає і його неможливо застосувати безпосередньо.
Тобто відносний поправочний коефіцієнт 'компонента є компонентом і еталонним матеріалом s
Відношення абсолютних поправочних коефіцієнтів.
Можна побачити, що відносний поправочний коефіцієнт - це коли якість компонента порівняно зі стандартом.
Коли речовина s дорівнює, площа піку еталонного матеріалу є площею піку компонента
множинний.Якщо якийсь компонент має масу m і площу піку A, то число f'A
Значення дорівнюють площі піку еталонного матеріалу масою.Іншими словами,
За допомогою відносного коригувального коефіцієнта можна відокремити площі піків кожного компонента
Перетворюється в площу піку еталонного матеріалу, що дорівнює його масі, потім у відношенні
Стандарт уніфікований.Отже, це нормалізований метод визначення відсотка кожного компонента
Основа кількості.
Спосіб отримання відносного поправочного коефіцієнта: значення відносного поправочного коефіцієнта порівнювали лише з буттям
Вимірювання пов’язане зі стандартом і типом детектора, але з операційною стрічкою
Це неважливо.Тому значення можна отримати з посилань у літературі.Якщо текст
Якщо ви не можете знайти потрібну вартість в пропозиції, ви також можете визначити її самостійно.Метод визначення
Метод: Певна кількість вимірюваної речовини з десяти вибраних еталонних матеріалів → доводиться до певної концентрації
Вимірювали площі хроматографічних піків A і As двох компонентів.
Це формула.
3. Кількісний метод розрахунку
(1) Метод нормалізації площі
Для кількісного визначення сума вмісту всіх фракцій без піків була розрахована як 100%.
Метод називається нормалізацією.Формула його розрахунку виглядає наступним чином:
Де Р,% - процентний вміст досліджуваних компонентів;A1, A2... A n є компонентом 1. Площа піку 1~n;f'1, f'2... f'n — відносний поправочний коефіцієнт для компонентів 1-n.
(2) метод зовнішнього стандарту
Метод кількісного порівняння між сигналом відповіді компонента, що тестується у зразку, і чистого компонента, який тестується як контроль.
(3) Метод внутрішнього стандарту
Так званий метод внутрішнього стандарту - це метод, при якому певну кількість чистої речовини додають до стандартного розчину досліджуваної речовини та розчину зразка як внутрішнього стандарту, а потім аналізують і визначають.
(3) стандартний метод додавання
Стандартний метод додавання, також відомий як метод внутрішнього додавання, полягає в додаванні певної кількості (△C)
Еталон досліджуваної речовини додавали до розчину зразка, що підлягає дослідженню, і тест додавали до аналізу
Пік розчину зразка після речовини був вищим, ніж у вихідного розчину зразка
Приріст площі (△A) використовували для розрахунку концентрації речовини в розчині зразка
Вміст (Cx)
Де Ax — площа піку речовини, що вимірюється у вихідному зразку.
Час публікації: 27 березня 2023 р